Quanto tempo può trascorrere realmente tra il campionamento di un’acqua e l’inizio dell’analisi?
Per molti laboratori la risposta arriva direttamente dal metodo di prova o dalle tabelle della ISO 5667-3. Ma cosa succede quando il laboratorio vuole utilizzare un tempo di conservazione differente? Oppure quando deve dimostrare che, nelle proprie condizioni operative, l’analita rimane effettivamente stabile per il periodo dichiarato?
È proprio a questo problema che risponde la ISO/TS 5667-25:2022 – Water quality — Sampling — Part 25: Guideline on the validation of the storage time of water samples.
La specifica tecnica, pubblicata nel 2022 e confermata da ISO nel 2025, fornisce indicazioni per progettare studi finalizzati a definire e verificare il periodo durante il quale un analita può essere considerato stabile in un campione d’acqua sottoposto a specifiche condizioni di conservazione. (ISO)
Holding time: non è semplicemente “il numero di giorni”
Quando si parla di holding time si tende spesso a ragionare esclusivamente in termini temporali:
24 ore, 48 ore, 7 giorni, un mese.
In realtà, il concetto è molto più articolato.
La stabilità deve essere associata contemporaneamente a condizioni definite di matrice, temperatura, esposizione alla luce, eventuale aggiunta di stabilizzanti, modalità di conservazione e altre condizioni pertinenti. La ISO/TS 5667-25 nasce proprio per valutare la stabilità dell’analita tenendo sotto controllo questi fattori. (ISO)
Di conseguenza, un’affermazione del tipo:
“L’analita è stabile per 7 giorni”
è incompleta.
Una conclusione tecnicamente più corretta dovrebbe essere del tipo:
“Nelle matrici e nelle condizioni di conservazione oggetto dello studio, il parametro mantiene caratteristiche compatibili con il criterio di stabilità adottato per almeno 7 giorni.”
La differenza è sostanziale.
Il collegamento con la UNI EN ISO 5667-3:2024
La questione è diventata ancora più interessante con la pubblicazione della UNI EN ISO 5667-3:2024, relativa alla conservazione e alla manipolazione dei campioni d’acqua.
La ISO 5667-3 specifica i requisiti generali per campionamento, conservazione, preparazione, trasporto e stoccaggio dei campioni e richiama espressamente la ISO/TS 5667-25 per la validazione dei tempi di conservazione. (ISO)
Il principio operativo è particolarmente importante per i laboratori: i tempi e le condizioni indicati dalla ISO 5667-3 costituiscono un riferimento generale, ma condizioni e tempi differenti possono essere sostenuti quando il laboratorio dispone di evidenze di validazione riferite alle proprie circostanze e matrici.
Questo sposta il problema da:
“Qual è il tempo indicato nella tabella?”
a:
“Quali evidenze possiedo per dimostrare che il campione è ancora idoneo all’analisi dopo quel tempo?”
Prima di validare l’holding time bisogna conoscere il metodo
Uno degli aspetti più interessanti della ISO/TS 5667-25 è che lo studio di stabilità non dovrebbe essere affrontato indipendentemente dalle prestazioni del metodo analitico.
ISO specifica infatti che, per effettuare lo studio, è necessario disporre di un metodo le cui prestazioni siano già state caratterizzate, considerando aspetti quali ripetibilità, precisione intermedia, correttezza/accuratezza e incertezza di misura. (ISO)
Questo requisito ha una conseguenza pratica fondamentale.
Se misuriamo:
100 µg/L al tempo T0
e:
94 µg/L dopo 72 ore
non possiamo concludere automaticamente che il campione abbia perso il 6% dell’analita.
Quella differenza deve essere interpretata rispetto alla variabilità propria del sistema di misura.
Una parte della variazione osservata potrebbe infatti essere dovuta al metodo analitico e non alla degradazione del campione.
La validazione dell’holding time è quindi uno studio di stabilità, non semplicemente una serie di analisi effettuate in giorni differenti.
Come impostare lo studio
La ISO/TS 5667-25 descrive diversi possibili disegni sperimentali e comprende studi cronologici, pseudo-isocroni e isocroni, oltre alla successiva rappresentazione dei dati, alla loro validazione e alla determinazione del massimo intervallo accettabile prima dell’analisi. (Standards)
Indipendentemente dal disegno scelto, prima di iniziare il laboratorio dovrebbe definire almeno:
- analita o gruppo di analiti;
- matrice o matrici rappresentative;
- livello o livelli di concentrazione da investigare;
- tipo di contenitore;
- eventuale filtrazione;
- stabilizzante o conservante utilizzato;
- temperatura e condizioni di conservazione;
- esposizione o protezione dalla luce;
- tempi di prova;
- numero di repliche;
- metodo analitico utilizzato;
- prestazioni note del metodo;
- criterio statistico e criterio di accettazione utilizzati per definire la stabilità.
Il punto fondamentale è che queste condizioni devono essere stabilite prima di osservare i risultati.
Definire il criterio di accettazione a posteriori, dopo aver visto l’andamento dei dati, renderebbe molto più debole la dimostrazione.
T0 è il punto di partenza dello studio
Il risultato ottenuto al tempo iniziale T0 assume un ruolo fondamentale.
Non è sufficiente produrre un valore e utilizzarlo automaticamente come riferimento.
La struttura della ISO/TS comprende infatti una fase specifica di validazione iniziale dello studio a T0, con determinazione del valore assegnato iniziale e verifica dell’accuratezza, prima di procedere alla valutazione dei tempi successivi. (Standards)
È un concetto importante anche nell’ottica ISO/IEC 17025: la stabilità può essere valutata correttamente soltanto se il sistema analitico utilizzato per osservarla è sotto controllo.
Non basta confrontare ogni risultato con T0
Un approccio molto semplice potrebbe essere:
T0 = 100 µg/L
T1 = 99 µg/L
T2 = 97 µg/L
T3 = 93 µg/L
e decidere che il parametro rimane stabile fino a quando la differenza percentuale non supera, ad esempio, un limite stabilito internamente.
Un confronto di questo tipo può essere utile come prima visualizzazione, ma uno studio strutturato deve considerare anche la variabilità analitica, le repliche, l’andamento complessivo dei risultati e il criterio di accettabilità definito nel protocollo.
La ISO/TS 5667-25 dedica infatti specifiche fasi alla rappresentazione grafica dei dati, alla loro validazione e alla determinazione del massimo ritardo accettabile prima dell’analisi.
L’obiettivo finale non è semplicemente dimostrare che esiste una differenza.
Occorre stabilire quando quella differenza diventa sufficientemente importante da non consentire più di considerare stabile il parametro nelle condizioni investigate.
Un esempio pratico
Supponiamo che un laboratorio voglia verificare se un determinato parametro possa essere analizzato fino a 7 giorni dal campionamento.
Potrebbe pianificare, a titolo puramente esemplificativo, analisi ai tempi:
T0 – T1 giorno – T2 giorni – T3 giorni – T5 giorni – T7 giorni – eventualmente T10 giorni.
Le aliquote dovrebbero essere preparate e conservate secondo condizioni controllate e documentate.
Il laboratorio analizzerà quindi l’andamento del parametro e confronterà le variazioni osservate con il criterio di stabilità stabilito dal protocollo, tenendo conto delle prestazioni del metodo.
Se le evidenze dimostrano che il campione mantiene caratteristiche accettabili fino a T7 ma non più a T10, la conclusione dello studio potrà supportare un holding time massimo di 7 giorni nelle specifiche condizioni investigate.
Non significa automaticamente che tutti i campioni d’acqua siano stabili per 7 giorni.
Significa che lo studio ha prodotto evidenze per quella combinazione di analita, matrice e condizioni di conservazione.
La matrice è fondamentale
Un altro errore sarebbe effettuare lo studio esclusivamente su acqua ultrapura fortificata e trasferire automaticamente il risultato ad acque reflue, superficiali, sotterranee o potabili.
La ISO/TS considera esplicitamente la matrice tra i fattori che definiscono le condizioni dello studio. (ISO)
La presenza di solidi sospesi, sostanza organica, microrganismi, salinità, pH o concentrazioni elevate di altre sostanze può modificare in maniera sostanziale la stabilità di un analita.
La scelta delle matrici da utilizzare nello studio deve quindi essere tecnicamente giustificata rispetto al campo di applicazione del laboratorio.
Holding time e ISO/IEC 17025
Dal punto di vista dell’accreditamento, il tema è particolarmente rilevante.
Il tempo che trascorre tra il campionamento e l’analisi può infatti diventare una componente critica dell’intero processo di prova.
Non basta quindi inserire nel LIMS una regola del tipo:
“campione valido per 72 ore”.
Il laboratorio dovrebbe essere in grado di ricostruire da dove deriva quel limite: norma, metodo ufficiale, documentazione tecnica oppure validazione effettuata internamente.
Quando si decide di adottare condizioni differenti rispetto a quelle normalmente indicate dal metodo o dalla documentazione normativa, la disponibilità di uno studio documentato diventa particolarmente importante.
La ISO/TS 5667-25 fornisce proprio un quadro metodologico con cui trasformare un’affermazione sulla stabilità del campione in una evidenza sperimentale documentata.
E per i campioni microbiologici?
Attenzione a un limite importante.
La ISO/TS 5667-25:2022 non si applica ai metodi biologici e microbiologici. Il suo campo di applicazione riguarda la valutazione della stabilità prima dell’esecuzione di protocolli analitici chimici e fisico-chimici. (ISO)
Non è quindi corretto utilizzare automaticamente questo approccio per giustificare, ad esempio, tempi di conservazione di campioni destinati alla ricerca microbiologica.
La vera domanda non è “quanto posso conservare il campione?”
L’approccio introdotto dalla ISO/TS 5667-25 suggerisce una domanda più completa:
“Per quanto tempo posso dimostrare che il campione rimane idoneo alla determinazione dell’analita, nella matrice e nelle condizioni di conservazione che utilizzo realmente?”
È un cambio di prospettiva importante.
L’holding time smette di essere un numero copiato in una procedura e diventa un parametro tecnicamente giustificato del processo analitico.
Per i laboratori che operano secondo la UNI CEI EN ISO/IEC 17025, soprattutto quando gestiscono molte matrici ambientali e tempi logistici complessi tra campionamento, trasporto e analisi, strutturare correttamente queste verifiche può diventare un elemento importante per la robustezza del metodo e per la difendibilità del risultato.
Devi definire o verificare gli holding time nel tuo laboratorio? DN Consulenze supporta i laboratori nella progettazione degli studi di stabilità, nella validazione dei metodi e nella predisposizione delle evidenze secondo ISO/IEC 17025.
Riferimenti
ISO/TS 5667-25:2022 — Water quality — Sampling — Part 25: Guideline on the validation of the storage time of water samples.
UNI EN ISO 5667-3:2024 — Qualità dell’acqua — Campionamento — Parte 3: Conservazione e manipolazione dei campioni d’acqua.