Test TOST nei laboratori ISO/IEC 17025: perché p > 0,05 non dimostra equivalenza tra metodi

DN Consulenze · Statistica applicata · Validazione metodi · ISO/IEC 17025

Due metodi analitici non mostrano una differenza statisticamente significativa. Possiamo concludere che siano equivalenti? La risposta è no: il test t tradizionale e un test di equivalenza rispondono a domande differenti. Il TOST (Two One-Sided Tests) aiuta a verificare se la differenza media può essere ritenuta sufficientemente piccola rispetto a limiti tecnici stabiliti in anticipo.

In questo articolo esaminiamo un caso numerico completo con 12 confronti appaiati, la relazione tra intervalli di confidenza e margini di equivalenza, le condizioni d’uso e gli errori da evitare nei laboratori conformi alla UNI CEI EN ISO/IEC 17025. Il riferimento di approfondimento è la scheda Eurachem, The Two One-Sided t-Test (TOST), prima edizione inglese marzo 2026, pubblicata online ad aprile 2026.

1. Il limite del test t: un p-value elevato non prova l’uguaglianza

Nel confronto usuale tra due medie, il test t prende in esame l’ipotesi nulla H₀: differenza media = 0. Se si ottiene, per esempio, p = 0,20, al livello di significatività del 5% non si rifiuta H₀. Non significa però che la differenza vera sia zero: i dati possono essere troppo pochi o dispersi per permettere una decisione.

Il problema si presenta spesso nel confronto tra due procedure analitiche, tra strumenti differenti o dopo una modifica di metodo. Scrivere «p > 0,05, quindi i due metodi sono equivalenti» attribuisce al test una conclusione che non è stato progettato per sostenere.

2. Il TOST ribalta la domanda statistica

Il Two One-Sided Tests verifica l’equivalenza della differenza media entro due margini L e U, scelti sulla base dell’uso previsto prima di guardare i risultati. Se il laboratorio ritiene accettabile una differenza media tra −5% e +5%, allora stabilisce L = −5% e U = +5%. Questi margini sono un’ipotesi didattica, non un criterio universale fissato dalla ISO/IEC 17025.

• Primo test unilaterale: la differenza media vera è maggiore del limite inferiore L?
• Secondo test unilaterale: la differenza media vera è minore del limite superiore U?

Entrambi i test devono risultare significativi per affermare l’equivalenza al livello α prescelto. Nella formulazione t standard, con α = 0,05, ciò coincide con la richiesta che l’intervallo di confidenza bilaterale al 90% della differenza media sia interamente compreso tra L e U.

3. Esempio numerico: 12 campioni confrontati con due metodi

Immaginiamo un laboratorio che confronti il metodo in uso con un nuovo metodo per lo stesso analita. Si analizzano 12 campioni distinti con entrambe le procedure. Per ciascun campione si determina la differenza relativa: 100 × (risultato nuovo − risultato di riferimento) / risultato di riferimento. Il denominatore deve essere appropriato e non prossimo a zero; ai livelli bassi può essere preferibile lavorare in unità di concentrazione assolute.

Il laboratorio ha definito preventivamente un margine di equivalenza della differenza media pari a ±5 punti percentuali. Queste le 12 differenze appaiate, inventate a scopo didattico:

Le differenze, nell’ordine, sono 0, +2, 0, +2, −1, +3, −1, +3, −2, +4, −3, +5%. Si ottengono:

• n = 12 coppie indipendenti;
• D̄ = +1,000 punti percentuali, differenza media;
• s_D = 2,523 punti percentuali, deviazione standard campionaria delle differenze;
• SE = s_D/√12 = 0,728 punti percentuali, errore standard;
• ν = 11 gradi di libertà.

Prima analisi: test t bilaterale sulla differenza da zero

Si calcola t = D̄/SE = 1,373. Con 11 gradi di libertà il risultato è p ≈ 0,197. Non vi sono evidenze sufficienti per affermare che la differenza media sia diversa da zero al livello del 5%.

Seconda analisi: TOST per dimostrare equivalenza entro ±5%

Il quantile t unilaterale al 95%, per 11 gradi di libertà, è circa 1,796. L’intervallo di confidenza bilaterale al 90% risulta:

L’intero intervallo appartiene alla regione compresa fra −5% e +5%. Anche i due test unilaterali hanno p < 0,001. Si può quindi affermare l’equivalenza della differenza media rispetto ai margini predefiniti, sotto le ipotesi del modello impiegato.

Non c’è contraddizione: il test t convenzionale non evidenzia una differenza da zero (p = 0,197), mentre il TOST fornisce evidenze che la differenza sia abbastanza contenuta. Sono quesiti diversi.

4. Media quasi perfetta, ma equivalenza non dimostrata

Consideriamo una differenza media ancora pari a +1%, ma con IC al 90% da −7% a +9%. La media è vicina a zero, tuttavia la stima è troppo incerta per escludere differenze tecnicamente importanti. L’intervallo oltrepassa i margini −5% e +5%: il TOST non consente di dimostrare l’equivalenza.

Questo esito non prova automaticamente che i metodi non siano equivalenti: significa che lo studio, così com’è, non ha prodotto evidenze sufficienti. Può essere necessario riprogettare il confronto o acquisire misure più informative, non semplicemente aumentare il numero di repliche strumentali dello stesso estratto.

5. Il vero nodo: come scegliere i limiti di equivalenza?

Il ±5% dell’esempio non è una soglia prevista genericamente dalla ISO/IEC 17025. I margini devono essere giustificati in base all’uso previsto: requisiti del metodo e del cliente, livelli di concentrazione decisionali, prestazioni richieste, conseguenze di classificazioni errate, precisione, bias e incertezza di misura. In particolari applicazioni i margini possono anche essere asimmetrici, come nell’esempio sui recuperi illustrato da Eurachem.

Un unico confronto globale può nascondere effetti importanti: ad esempio, differenze negative vicino al LOQ e positive alle alte concentrazioni che si compensano nella media. In tali casi occorre valutare la dipendenza dalla concentrazione e progettare un confronto per livelli, matrici o intervalli rappresentativi.

6. Come utilizzare il TOST in un laboratorio ISO/IEC 17025

Il TOST può contribuire a documentare un aspetto circoscritto della comparabilità dei metodi, per esempio l’equivalenza del bias medio entro limiti stabiliti. Non dimostra da solo che due procedure siano identiche o intercambiabili sotto ogni profilo e non sostituisce una verifica o validazione completa secondo lo scopo dichiarato.

In particolare, quando applicabile, occorre valutare indipendentemente precisione, selettività, recupero, campo di misura, LOQ, effetti di matrice, robustezza, incertezza e validità dei risultati. La struttura dello studio conta quanto il test: due misure sugli stessi campioni richiedono un modello appaiato; campioni indipendenti richiedono un modello differente. Vanno inoltre considerate le ipotesi sulla distribuzione delle differenze, sull’indipendenza delle unità sperimentali e sulle fonti di variabilità effettivamente campionate.

7. Protocollo operativo: otto passaggi

1. Identificare la caratteristica da confrontare: bias medio, risultati in un livello di concentrazione, prestazioni lungo il campo, ecc.
2. Fissare L e U prima delle prove e documentare la giustificazione tecnica.
3. Selezionare campioni rappresentativi di concentrazioni e matrici pertinenti.
4. Definire numero e indipendenza delle prove: campione, preparazione, iniezione non sono automaticamente equivalenti.
5. Pianificare la potenza con dispersione e numerosità compatibili con i margini desiderati.
6. Verificare le condizioni di applicabilità del modello statistico e l’eventuale dipendenza dalla concentrazione.
7. Calcolare e archiviare differenze, intervalli, test unilaterali e decisioni.
8. Concludere senza generalizzazioni specificando condizioni, matrici e proprietà per cui l’equivalenza è sostenuta.

8. Cinque errori da non riportare in un rapporto di validazione

• Scrivere «p > 0,05, quindi i metodi sono equivalenti».
• Scegliere i margini dopo avere visto i risultati.
• Estendere l’equivalenza della differenza media a tutte le prestazioni del metodo.
• Contare 30 iniezioni dello stesso estratto come 30 campioni indipendenti.
• Interpretare un TOST non significativo come prova certa di non-equivalenza.

Riferimenti per approfondire

• Eurachem, The Two One-Sided t-Test (TOST), prima edizione inglese marzo 2026, pubblicazione online il 17 aprile 2026. PDF originale.
• Lakens, Equivalence Tests: A Practical Primer for t Tests, Correlations, and Meta-Analyses (2017).
• A Primer on the Use of Equivalence Testing for Evaluating Measurement Agreement.
• ASTM E2935-21, Standard Practice for Evaluating Equivalence of Two Testing Processes.
• UNI CEI EN ISO/IEC 17025, requisiti pertinenti ai metodi e all’assicurazione della validità dei risultati.

Gli esempi sono simulati a scopo didattico e non sostituiscono la verifica dei requisiti applicabili al metodo e all’uso previsto dei risultati.