Una diluizione 1:10 può aumentare di dieci volte il LOQ riferito al campione originale. Un effetto apparentemente semplice, ma decisivo per l’affidabilità dei risultati, per i controlli del LIMS e per le eventuali dichiarazioni di conformità sul rapporto di prova (RdP).
Questo problema interessa i laboratori che analizzano acque, terreni, rifiuti ed eluati, soprattutto con ICP-MS, ICP-OES, cromatografia ionica e tecniche cromatografiche. Analizziamo le formule, due esempi pratici e le verifiche da effettuare prima di autorizzare il rapporto.
1. LOQ strumentale e LOQ del metodo: la differenza
Il LOQ strumentale riguarda la soluzione che entra nello strumento. Il LOQ del metodo riguarda il procedimento analitico applicato al campione, incluse preparazione, eventuali estrazioni o mineralizzazioni, bianco, interferenze di matrice e fattori di diluizione o concentrazione.
La guida Eurachem The Fitness for Purpose of Analytical Methods, terza edizione 2025 tratta la verifica e validazione delle caratteristiche prestazionali, compreso il limite di quantificazione. Il valore fornito dal software dello strumento non è automaticamente il LOQ applicabile a qualsiasi campione.
2. La formula: il LOQ aumenta con il fattore di diluizione
Se il campione acquoso viene analizzato direttamente e non intervengono altri fattori di preparazione, vale la relazione:
LOQ riferito al campione = LOQ strumentale × Fd
Con Fd = Vfinale / Valiquota. Prelevare 1 mL e portare a 10 mL corrisponde a Fd = 10. Se il LOQ dello strumento è 0,5 µg/L, una diluizione 1:10 corrisponde a un LOQ teorico riferito al campione pari a 5 µg/L.
Nel seguente esempio assumiamo, per semplicità, che il LOQ di 0,5 µg/L sia stato anche verificato come LOQ del metodo sul campione non diluito e che le diluizioni aggiuntive siano compatibili con le prestazioni dimostrate.
| Diluizione | Fattore | LOQ riferito al campione | Espressione se inferiore al LOQ |
|---|---|---|---|
| Nessuna | 1 | 0,5 µg/L | < 0,5 µg/L |
| 1:2 | 2 | 1,0 µg/L | < 1,0 µg/L |
| 1:5 | 5 | 2,5 µg/L | < 2,5 µg/L |
| 1:10 | 10 | 5,0 µg/L | < 5,0 µg/L |
| 1:20 | 20 | 10 µg/L | < 10 µg/L |
| 1:50 | 50 | 25 µg/L | < 25 µg/L |
| 1:100 | 100 | 50 µg/L | < 50 µg/L |
3. Il LOQ validato del metodo resta il punto di partenza
La proporzionalità serve a convertire il limite della soluzione di misura in quello del campione originale, ma non sostituisce la verifica delle prestazioni del metodo. Supponiamo che il LOQ strumentale sia 0,5 µg/L ma quello verificato del metodo sul campione non diluito sia 1,0 µg/L. In questo caso non sarebbe corretto stampare «< 0,5 µg/L» sul RdP.
Se una successiva diluizione 1:10 rientra nelle condizioni operative dimostrate come idonee, il LOQ derivato da quello del metodo sale a 10 µg/L. Interferenze e condizioni operative differenti potrebbero richiedere un LOQ maggiore: la sola moltiplicazione non dimostra la prestazione.
4. L’esempio per terreni e rifiuti: massa, volume e diluizione
Per i campioni solidi, dopo mineralizzazione o estrazione, occorre considerare anche la massa iniziale e il volume finale. Quando il LOQ della soluzione è espresso in mg/L:
LOQ [mg/kg] = LOQ soluzione [mg/L] × Vfinale [L] × Fd / mcampione [kg]
Esempio: 0,500 g di campione mineralizzati e portati a 50 mL; LOQ strumentale = 0,5 µg/L, ossia 0,0005 mg/L. Il solo LOQ teorico ricavato dallo strumento corrisponde a 0,05 mg/kg senza ulteriore diluizione e a 0,50 mg/kg dopo un’ulteriore diluizione 1:10. Il LOQ riportabile rimane comunque soggetto alle prestazioni del procedimento completo e alla matrice.
Se il risultato va espresso sulla sostanza secca, bisogna aggiungere la relativa conversione, ove applicabile, e verificare che il LIMS non confonda mg/L della soluzione con mg/kg del campione.
5. Cosa riportare sul rapporto di prova?
Consideriamo due campioni dello stesso parametro. Il primo è misurato senza diluizione aggiuntiva, il secondo con diluizione 1:10. Supponiamo che entrambi forniscano un segnale inferiore al rispettivo LOQ e che le prestazioni del metodo siano adeguate nelle due condizioni.
| Informazione | Campione A | Campione B |
|---|---|---|
| Diluizione aggiuntiva | Nessuna | 1:10 |
| LOQ applicabile | 0,5 µg/L | 5,0 µg/L |
| Risultato sul RdP | < 0,5 µg/L | < 5,0 µg/L |
Riportare per entrambi «< 0,5 µg/L» attribuirebbe al campione B una capacità di quantificazione non dimostrata. Inoltre, «< 5,0 µg/L» non equivale a «zero» e non prova che il campione sia sotto 0,5 µg/L.
L’indicazione del fattore esatto di diluizione in una nota al RdP non è automaticamente obbligatoria per ogni prova: dipende dal metodo applicato, dai requisiti pertinenti, dagli accordi con il cliente e dalla necessità di interpretare il risultato. Il limite riportato deve però essere quello effettivamente riferito al campione.
6. Se il LOQ supera il limite da valutare
Immaginiamo un limite massimo puramente ipotetico di 5 µg/L. Dopo una diluizione 1:20, un LOQ di 0,5 µg/L diventa 10 µg/L: un risultato «< 10 µg/L» non consente di stabilire se il campione sia al di sopra o al di sotto di 5 µg/L.
Prima di emettere una dichiarazione di conformità il laboratorio deve verificare gli eventuali requisiti applicabili al LOQ, la regola decisionale e la possibilità di ridurre la diluizione, rimuovere le interferenze o usare una tecnica più idonea. Quando il LOQ è troppo elevato, la limitazione analitica deve essere gestita e comunicata: «inferiore al LOQ» non significa automaticamente «conforme».
7. I riferimenti della UNI CEI EN ISO/IEC 17025
La UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018 richiede la corretta gestione delle prestazioni dei metodi e dei risultati. Per questa problematica sono particolarmente pertinenti:
- § 7.2: metodi, verifica e validazione rispetto all’utilizzo previsto;
- § 7.5: registrazioni tecniche e tracciabilità di preparazione, diluizioni e calcoli;
- § 7.6: valutazione degli effetti pertinenti sull’incertezza di misura;
- § 7.7: controlli per assicurare la validità dei risultati;
- § 7.8: presentazione chiara, accurata e non fuorviante dei risultati;
- § 7.8.6: regola decisionale quando sono richieste dichiarazioni di conformità.
Una diluizione prevista e verificata nel metodo non costituisce di per sé una deviazione da dichiarare; condizioni operative non coperte dalle prestazioni dimostrate richiedono invece una gestione tecnica specifica prima dell’emissione del dato.
8. Il LIMS deve applicare un LOQ variabile per campione
Un sistema che memorizza un unico LOQ fisso per analita senza considerare le diluizioni rischia di produrre risultati non corretti. La gestione informatizzata dovrebbe prevedere almeno:
- LOQ strumentale, LOQ del metodo verificato e relativa matrice;
- massa, volumi, fattori di preparazione e successive diluizioni, con corrette unità di misura;
- LOQ ricalcolato e applicabile al singolo campione;
- esito dei controlli di qualità delle sequenze e delle soluzioni diluite;
- corretta espressione «< LOQ» e regole di arrotondamento;
- segnalazione dei casi in cui il LOQ supera il limite da valutare.
Test pratico del LIMS: simulare lo stesso parametro su campioni con diluizioni 1:1 e 1:10 e controllare che sul rapporto di prova compaiano LOQ diversi. Verificare anche che non venga generato automaticamente un giudizio di conformità quando il LOQ non consente il confronto richiesto.
9. Tre errori da evitare
- Usare sempre il LOQ strumentale: deve essere dimostrata l’idoneità dell’intero procedimento per il campione.
- Diluire senza aggiornare il LOQ: i fattori di diluizione e di preparazione devono essere applicati correttamente.
- Confondere «< LOQ» con «assenza» o «conformità»: un valore inferiore al LOQ può essere insufficiente per valutare un limite più basso.
Conclusioni
Diluire è spesso necessario per limitare gli effetti di matrice o rientrare nel campo di misura. Ma ogni diluizione deve essere accompagnata dal ricalcolo del LOQ riferito al campione e dalla verifica delle prestazioni effettivamente dimostrate. Il RdP deve rappresentare ciò che il laboratorio è realmente in grado di quantificare.
Riferimenti tecnici
- UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018, §§ 7.2, 7.5, 7.6, 7.7 e 7.8.
- Eurachem, The Fitness for Purpose of Analytical Methods, terza edizione 2025.
- ILAC G8:09/2019, Guidelines on Decision Rules and Statements of Conformity.
DN Consulenze supporta i laboratori nella verifica e validazione dei metodi, nella determinazione e gestione dei LOQ, nella valutazione dell’incertezza e nel controllo dei rapporti di prova. Scopri il servizio di validazione dei metodi ISO/IEC 17025 oppure richiedi un confronto tecnico sul tuo caso.